Biochémia nukleových kyselín II

1. Úvod do problematiky génového inžinierstva: základná stratégia, charakteristika dielčích postupov používaných pri manipulácii s genetickým materiálom (2 hod.).
2. Izolácia nukleových kyselín: princípy izolácie DNA, RNA (2 hod.).
3. Enzýmy v génovom inžinierstve: polymerázy, restrikčné endonukleázy, nukleázy, ligázy, fosfatázy, transferázy, kinázy, topoizomerázy (4 hod.).
4. Príprava rekombinantných DNA: základné požiadavky na vektory, klasifikácia vektorov podľa mechanizmu replikácie, expresné vektory, fragmentácia, úprava a značenie fragmentov, adaptorové molekuly, ligácia fragmentov DNA, príprava kompetentných buniek, transformácia rekombinantnej DNA, selekcia rekombinantov, stabilita transformovaných buniek, genómové knižnice (6 hod.).
5. Amplifikačné metódy: PCR, stratégia a celkové požiadavky (2 hod.).
6. Sekvenčná analýza: primerová syntéza, +/- metóda, sekvenovanie krátkych oligonukleotidov, Sangerova terminačná metóda, použitie fágovej DNA M13, Maxam-Gilbertova chemická metóda, syntéza oligonukleotidov, cielená mutagenéza, SELEX (2 hod.).
7. Bioinformatika: Analýza sekvencií a získavanie dát (2 hod.).
8. Praktické aplikácie: diagnostika dedičných a nádorových ochorení, génová terapia, molekulárna genetika priemyselne dôležitých mikroorganizmov, génové manipulácie bachorových baktérií (2-4 hod.).

Doporúčená literatúra:

• Turňa, J. a kol.: Rekombinantné DNA a biotechnológie, Alfa, Bratislava, 1990
• Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982

Praktikum z biochémie nukleových kyselín

Úlohy

• Základné laboratórne techniky: Základné princípy prípravy sterilných materiálov a roztokov, technika používania automatických pipiet, zloženie a príprava roztokov pre izoláciu chromozomálnej a plazmidovej DNA, príprava tekutých a pevných kultivačných médií, príprava antibiotických agarových platní, stanovenie rastovej krivky E. coli HB101, určovanie bakteriálnych počtov v tekutej kultúre vyriedením a vysievaním, izolácia individuálnej bakteriálnej kolónie, preočkovávanie bakteriálnych kolónií.
• Izolácia chromozomálnej DNA: izolácia chromozomálnej DNA z grampozitívnych (Streptococcus bovis 47/3) a z gramnegatívnych (E. coli HB101) bakteriálnych buniek, kontrola kvality izolovanej DNA pomocou ELFO.
• Izolácia plazmidovej DNA: izolácia plazmidov pUC19 a pBR322 (metódou alkalickej lýzy a boiling metódou), restrikčná analýza izolovaných plazmidov, ELFO.
• Elektrofóreza v agarózovom géli: príprava gélov, spektrofotometrické stanovenie čistoty a koncentrácie DNA v roztokoch, určenie koncentrácie DNA v agarózovom géli, stanovenie molekulovej hmotnosti fragmentov DNA v agarózovom géli, stanovenie jednotlivých foriem plazmidovej DNA.
• Príprava rekombinantnej DNA: príprava génovej banky so Streptococcus bovis 47/3.
• Transformácia buniek E. coli: príprava kompetentných buniek E. coli HB101 pomocou CaCl2, príprava elektrokompetentných buniek, transformácia kompetentných buniek s ligačnou zmesou z predchádzajúceho cvičenia a s rekombinantnými plazmidmi obsahujúcimi lichenázový gén a lux gén.
• Identifikácia rekombinantných klonov, izolácia a analýza rekombinantnej DNA: vyhľadávanie kanamycín pozitívnych bakteriálnych klonov, stanovenie prítomnosti lichenázového a lux génu v transformantoch E. coli, izolácia rekombinantných plazmidov a restrikčná analýza klonovaného fragmentu DNA v pozitívnych transformantoch, ELFO.
• PCR: Princípy PCR, príprava reakčnej zmesi, analýza vzniknutého produktu, problémy spojené s prípravou PCR produktov.
• Analýza DNA pomocou PC: internetová dostupnost génových dátabáz a možnosti analýzy sekvencií DNA s využitím počítačových programov.